蛋白質是一切活細胞和有機體的最重要和最必需的組成成分，它是構成人體及所有動物機體組織干物質的主要部分。例如，人體按總量計算，干重54％是蛋白質，即除去水分后，蛋白質約占體重的一半左右，可見蛋白質是生命活動中最重要的物質基礎。

       蛋白質是由二十種氨基酸以肽鍵相互聯(lián)接而成的復雜的高分子化合物，它水解的最終產物是氨基酸。在蛋白質分子內又通過氫鍵、鹽鍵、疏水作用力構成蛋白質的空間結構，即蛋白質的構象（ conformation )。當蛋白質分子受到某些物理、化學因素影響時，它的空間結構就會發(fā)生改變或破壞，物理化學性質和生物學性質也隨著發(fā)生變化，稱為蛋白質的變性作用。因此在研究蛋白質的生物學功能時，應防止它的變性作用。

       蛋白質在溶液中的分子大小，溶解度，電荷，吸附性質和對其他分子的親和力等各不相同，根據這些因素，可以選擇一定的方法分離，制備和鑒定蛋白質。利用蛋白質肽鏈末端基的特點，還可以設計特殊的分析技術來測定蛋白質的一級結構。

       氨基酸是構成蛋白質的基本單位，它也是生物體維持生長所必需的營養(yǎng)物質，具有特殊的生理作用，參與生物機體的代謝。因此對氨基酸的分離測定在實際工作中也是重要的。

       蛋白質含量可從它們的物理化學性質，如折射率、比重，紫外吸收、染色等測定而得知；或用化學方法，如定氮、雙縮脲反應、 folin﹣酚試劑反應、BCA法等方法來測定。其中 Folin ﹣酚試劑法和考馬斯亮藍染色法是一般實驗室中經常使用的方法。而 Folin﹣酚試劑法靈敏度較高，較紫外吸收法靈敏10~20倍，而較雙縮脲法靈敏100倍左右。這類方法操作簡便、迅速，不需要復雜和昂貴的設備，又能適合一般實驗室的要求，若作一般測定較為適宜。

       一、雙縮脲法

       1.原理

        在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色絡合物，其顏色的深淺與蛋白質的含量成正比，而與蛋白質的相對分子質量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍1~10mg蛋白質。

        雙縮脲法常用于需要快速但并不需要十分精確的測定。硫酸銨不干擾此呈色反應，使其有利于對蛋白質純化早期步驟的測定。

        干擾此測定的物質包括在性質上是氨基酸或肽的緩沖劑，例如 Tris 緩沖液，因為它們給予陽性呈色反應。Cu2+也容易被還原，有時發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)紅色沉淀。

       2.試劑和器材

         ①試劑

    標準酪蛋白溶液（10mg/mL)：酪蛋自要預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度稱量配制成標準溶液。用0.05mol/L *溶液配制。亦可用10mg/ mL 牛血清清蛋白溶液。

       雙縮脲試劑：取1.50g硫酸銅（CuSO4•5H2O）和6.0g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O )，用500mL水溶解，在攪拌下加入300mL10％*溶液，用水稀釋到1000mL，貯存于塑料瓶中（或內壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需重新配制。

       ②器材

         分光光度計，恒溫水浴

       3．操作方法

        標準曲線的制定：取12只試管分成兩組，分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL的標準酪蛋白溶液，用水補足到1mL，然后各加入4mL雙縮脲試劑，充分搖勻后，在室溫下（20~25℃）放置30分鐘，于540nm處進行比色測定。取兩組測定的平均值，以酪蛋白的含量為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制標準曲線，作為定量的依據。

        用同樣的方法測定未知樣品，注意樣品濃度每ml不要超過10mg，否則要適當稀釋。

       二、Folin﹣酚試劑法（Lowry法）

         1.原理

         用于蛋白質測定的 Lowry 反應是雙縮脲方法的發(fā)展，第一步涉及到在堿性溶液中銅﹣蛋白質復合物的形成，然后這個復合物還原磷鉬酸﹣磷鎢酸試劑（Folin氏試劑），產生深藍色（鉬藍和鎢藍混合物）。這個測定法較雙縮脲法靈敏得多。對雙縮脲反應發(fā)生干擾的離子同樣容易干擾Lowry反應，而且對后者的影響還要大得多。所測蛋白質樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用。濃度較低的尿素（約0.5％左右）、胍（0.5％左右）、*（1%)、硝酸鈉(1%)、三氯乙SUAN（0.5%)、乙醇（5%)、乙MI（5%)、丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，這些物質濃度高時必須做校正曲線。含硫酸銨的溶液只須加濃碳酸鈉﹣*溶液即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后色淺，則必須提高碳酸鈉﹣*溶液的濃度1~2倍。

         進行測定時，加 Folin 氏試劑要特別小心，因為 Folin 氏試劑僅在酸性pH 條件下穩(wěn)定，但上述還原反應只是在pH10的情況下發(fā)生，故當Folin氏試劑加到堿性的銅﹣蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸﹣磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發(fā)生。

此法也適用于酪氨SUAN和色氨SUAN的定量測定。

       2.操作方法

    2.1樣品測定

           取1ml樣品溶液（約含20-250ug多肽或蛋白質），加入5ml試劑甲，混勻，于20~25℃保溫30分鐘，然后于500nm處比色。以1ml水樣替代品作為空白對照。

       2.2標準曲線的制定

           取14只試管分成兩組，分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL標準蛋白溶液（250ug/ml），用水補足到1mL，然后按上述方法進行操作，測定光吸收值。取兩組測定的平均值，以蛋白質濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線作為定量的依據。

          若用0.5cm光程的比色池進行比色，可按下面方法進行操作：取0.2ml樣品溶液（約含5~100ug多肽或蛋白質），加入1ml試劑甲（可選用0.3cm~0.5cm直徑的小試管），混勻，10分鐘后再加0.1ml試劑乙，立即搖勻，30分鐘后比色。若多肽或蛋白質濃度在5~25ug，則波長用755nm，25ug以上則采用500nm比色為宜。

       3.試劑和器材

          3.1試劑

1. 標準蛋白質溶液：可用結晶牛血清清蛋白或酪蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度配制成250ug/ml的溶液。

2. Folin-酚試劑的配制（均用分析純試劑）：

    試劑甲：由下述4種溶液配制的。（1）4％碳酸鈉（ Na2CO3）溶液；（2）0.2mol/L *溶液；（3）1％硫酸銅（ CuSO4•5H2O ）溶液；（4）2％酒石酸鉀鈉溶液（或酒石酸鉀、酒石酸鈉）。在使用前，將（1）與（2）等體積混合配成碳酸鈉﹣*溶液，將（3）與（4）等體積混合配成硫酸銅﹣酒石酸鉀鈉溶液。然后將這兩種溶液按50:1的比例混合，即為 Folin﹣酚試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效。

          試劑乙（ Folin 氏試劑）：市售福林酚試劑

       3.2器材

          分光光度計    恒溫水浴

       三、考馬斯亮藍染色法（Bradford法）

         1.原理

          1976年 Bradford 建立了用考馬斯亮藍 G -250與蛋白質結合的原理，迅速、敏感的定量測定蛋白質的方法。染料與蛋白質結合后引起染料最大吸收的改變，從465nm變?yōu)?95nm，光吸收增加。蛋白質﹣染料復合物具有高的消光系數，因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度，檢出量為1ug蛋白。染料與蛋白質的結合是很迅速的過程，大約只需2分鐘，結合物的顏色在1小時內是穩(wěn)定的。一些陽離子，如 K+ , Na+, Mg2+ ,( NH4)2SO4，乙醇等物質不干擾測定，而大量的去污劑如 TritonX -100, SDS 等嚴重干擾測定，少量的去污劑可通過用適當的對照而消除。以下試劑對考馬斯亮藍 G -250-蛋白質復合物有影響：1mol/LKCL、5mol/NaCL、1mol/LMgCL2、2mol/LTris、0.1mol/LEDTA、1mol/L(NH4)2SO4、99%乙醇、5%酚、丙酮、0.1%TritonX-100、1%TritonX-100、0.1%SDS、1%SDS。由于染色法簡單迅速，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應用于蛋白質含量的測定。

       2.操作方法

    2.1標準方法

     取含10~100ug蛋白質溶液于小試管中，用雙蒸水或緩沖液調體積到0.1mL ，然后加入5mL蛋白試劑，充分振蕩混合，2分鐘后于595nm測定光吸收值。以0.1mL 雙蒸水或緩沖液及5mL 蛋白試劑作為空白對照。

       2.2微量蛋白分析法

     取含1~10ug蛋白質溶液，用雙蒸水調體積到0.8mL，加0.2mL蛋白試劑，充分振蕩混合，2分鐘后于595nm測定光吸收值，以0.8mL雙蒸水及0.2mL蛋白試劑作為空白對照。

     用不同濃度的蛋白質溶液作標準曲線，以蛋白濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線作為定量的依據。

       3.試劑和器材

    試劑

1. 標準蛋白質溶液：可用牛血清清蛋白預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度配制成1mg/ mL 的溶液。或根據牛血清清蛋白的紫外消光系數 A1% 1cm＝6.6來確定。

2. 蛋白試劑的配制：稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%（W/V）磷酸，將溶液用水稀釋到1000ml。試劑的終濃度為0101%考馬斯亮藍G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸。

   器材

         分光光度計     微量注射器

       四、BCA法

          1.產品描述

             BCA（Bicinchonininc Acid）蛋白含量檢測法是用于總蛋白質定量的常用方法，BCA 與二價銅離 子混合即為 BCA 工作液，蛋白在堿性條件下能夠將 Cu2+還原為 Cu+，Cu+與 BCA 試劑可形成紫色絡 合物，產物在 562 nm 處具有特征吸收峰，通過吸光值變化即可定量檢測樣品的蛋白濃度。

          2.注意事項

            ①Copper Solution 與 PBS Diluent 可置于 2-8℃長期保存，若發(fā)現(xiàn)污染渾濁則應丟棄；BCA Solution 在低溫條件下出現(xiàn)結晶沉淀時，可 37℃溫育使其*溶解，不影響使用；

            ②為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作；

            ③BCA 法測定蛋白含量不受絕大部分樣品中化學物質的影響，樣品中 5% SDS、5% Triton X-100、 5% Tween20、60、80 等常用濃度去垢劑不影響檢測結果，但 EDTA 和 EGTA 等螯合劑、DTT 和巰基 乙醇等還原劑和脂類會影響檢測結果，需確保 EDTA 低于 10 mM、無 EGTA、二硫蘇糖醇低于 1 mM、 巰基乙醇低于 0.01%；若樣品含有較多干擾物質且本身背景值較高，建議使用 Bradford 法蛋白含量檢測試劑盒（Cat AKPR015）；

            ④若蛋白濃度較低時（小于 50 μg/mL），可將顯色溫度提高至 60℃且待測樣本

與工作液比例調整 為 1:8 進行測定，能夠明顯提高靈敏度至 5 μg/mL；

            ⑤為保證結果準確且避免試劑損失，測定前請仔細閱讀說明書（以實際收到說明書內容為準）， 確認試劑儲存和準備是否充分，操作步驟是否清楚，且務必取 2-3個預期差異較大的樣本進行預測定，過程中問題請您及時與工作人員聯(lián)系。